氯霉素具有廣譜抗菌作用。在需氧革蘭氏陽性細菌中，對草綠色鏈球菌、白喉桿菌、炭疽桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌等均敏感，對D組鏈球菌則相對不敏感；在需氧革蘭氏陰性菌中,對流感桿菌、志賀氏菌屬、百日咳桿菌、淋球菌及腦膜炎球菌均有良好抗菌作用，對沙門氏菌屬、大腸桿菌屬、奇異變形桿菌、霍亂弧菌等亦敏感,而對粘質塞拉蒂(原譯沙雷)氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏肺炎桿菌則不甚敏感。許多厭氧菌包括消化球菌、消化鏈球菌、產氣莢膜桿菌、梭形桿菌屬、脆弱擬桿菌等均能被其抑制。此外，對大部分立克次氏體、衣原體和菌質體均有效，但對綠膿桿菌、吲哚陽性變形桿菌、結核菌、真菌、病毒及原蟲則均無抑制作用。氯霉素經過長期臨床應用，各類細菌可不同程度地對其產生耐藥性，但是耐藥的程度則是因地因時而異。耐藥性產生的主要機理是菌體內帶有耐藥遺傳基因的質粒介導產生了氯霉素乙酰轉換酶，使氯霉素中丙二醇基因的3-羥位乙酰化，氯霉素因此不能與細菌核糖體的 50S亞基結合而失去活性。這種耐藥遺傳基因還可通過結合或移位等方式傳遞給同屬或不同屬的敏感菌使其變?yōu)槟退幘贿^，已獲得耐藥性的菌株，在停用藥物一段時間后，其耐藥性可以消失而重新變?yōu)槊舾?。菌?/p>